View source for 1997 Rechtsmedizin: Forensische Nutzbarkeit und Populationsdaten der beiden short tandem repeat-Systeme D8S306 und PKLR

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Quelle: Rechtsmedizin (1997)<br>
(angefertigt am Institut f&uuml;r Rechtsmedizin der Universit&auml;t zu K&ouml;ln)<br>

=<font color=orange>Forensische Nutzbarkeit und Populationsdaten der beiden</font>=
=<font color=orange>short tandem repeat-Systeme D8S306 und PKLR</font>=

[Weitere [[All Mark Benecke Publications|Artikel von MB]]] [Artikel [http://wiki2.benecke.com/index.php?title=Media#Interviews_.26_Articles <font color=lightgrey>über MB</font>]]<br>

'''VON MARK BENECKE, CORNELIA SCHMITT, MICHAEL STAAK'''<BR>


<font color=orange>Abstract</font><br>
Examining the properties of the two short tandem repeat (STR) loci PKLR and D8S306 for forensic applications we found both suitable for identification purposes and paternity cases. Due to its high sensitivity (lower detection limit) of down to 30 pg, D8S306 should be useful in stain analysis. The lower detection limit for PKLR is  250 pg. For both systems, population data of inhabitants of the Rhine area in and around K&ouml;ln (in the western part of Germany) show minor differences to the data given in the original papers; allele distributions shows Hardy-Weinberg equilibrium as confirmed by the Exact Test. Discriminating power for any person (stain analysis) is 0.96 for D8S301 and 0.94 for PKLR; exclusion chance in paternity cases is 0.68 for D8S306 and 0.54 for PKLR. Combining DNA amplification in a Perkin Elmer 2400 PCR machine with the Pharmacia A.L.F. Sequencer allowed DNA typing in one day. <br>


<font color=orange>Key words</font><br>
STR, PCR, D8S306, PKLR, DNA typing<br>


<font color=orange>Zusammenfassung</fonT><br>

Um die statistische Ausschlu&szlig;wahrscheinlichkeit der PCR-gest&uuml;tzten DNA-Typisierung durch zus&auml;tzliche STR-Systeme weiter zu erh&ouml;hen, stellen wir die zwei neuen Genorte D8S306 und PKLR vor. Besonders das hochsensitive System D8S306 sollte bei der Bearbeitung von geringen DNA-Mengen aus Spurenmaterial hilfreich sein. Die von uns gewonnenen Populationsdaten aus dem Rheinland in und um K&ouml;ln stehen f&uuml;r beide Systeme weitgehend in Einklang mit den Daten der Originalver&ouml;ffentlichungen; der Exact Test best&auml;tigt, da&szlig; die Allelverteilungen im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht sind. <br>


Die discriminating power liegt f&uuml;r D8S301 bei 0.96 und f&uuml;r PKLR bei 0.94, die exclusion chance f&uuml;r Vaterschaften bei 0.68 f&uuml;r D8S306 und 0.54 f&uuml;r PKLR. Folgt der DNA-Amplifikation mittels der Perkin Elmer 2400-Maschine eine Auftrennung der Produkte auf dem A.L.F.-Sequenzierger&auml;t (Pharmacia), ist die DNA-Typisierung innerhalb eines Tages m&ouml;glich.<br>


<font color=orange>Schl&uuml;sselworte</font><br>

Short Tandem Repeat, Polymerasekettenreaktion, D8S306, Pyruvatkinase L-Gen (PKLR), DNA-Typisierung<br>


<font color=orange>Einleitung</font><br>

Um die Ausschlu&szlig;wahrscheinlichkeiten der PCR-gest&uuml;tzten DNA-Typisierung weiter zu erh&ouml;hen, kann neben den h&auml;ufig benutzten und erprobten STR-Systemen wie HUMVWA31/A, HUMFES, HUMACTBP2, HUMTHO1 (e.g. [4], [11] and others) der Einsatz zus&auml;tzlicher STR-Systeme n&uuml;tzlich sein (z.B. HUMDHFRP2/HUMFOLP23 [1]). Neue STR-Systeme k&ouml;nnen auch bei der gleichzeitigen Vervielf&auml;ltigung mehrerer DNA-Loci, der Multiplex-PCR [4], eigesetzt werden. Besonders bei der Konstruktion von Multiplexsystemen, bei denen nur ein einziger Fluoreszenzfarbstoff als Marker der PCR-Produkte dient (z.B. bei der von uns durchgef&uuml;hrten Detektion mittels des A.L.F. Sequencers, Pharmacia Biotech), werden STR-Loci ben&ouml;tigt, deren PCR-Produkte sich nicht &uuml;berlappen. 
Aus diesem Grund untersuchten wir Sensitivit&auml;t, DNA-Mischungen und die Allelverteilungen in einer westdeutschen Population zweier neuer STR loci, D8S306 (Chromosom 8p [8]) und PKLR (Chromosom 1q [6]). <br>


<font color=orange>Material und Methoden</font><br>

Von phenolextrahierter DNA einer Zufallsstichprobe von Blutspendern wurden Verd&uuml;nnungsreihen (10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg) einiger Genotypen hergestellt und mit dem  QuantiBlot Human DNA Quantitation Kit (Perkin Elmer, Foster City, Ca.) und der Schleicher & Schuell Minifold Dot Blotting unit nach den Originalprotokollen der Hersteller quantifiziert. Als DNA-Mischungen dienten verschiedene Konzentrationen zweier Genotypen, die vor der Amplifikation in verschiedenen Verh&auml;ltissen miteinander gemischt wurden (Mengen: 200 pg bsi 5 ng; Verh&auml;ltnisse: 2.2:1, 2.5:1, 3.5:1, 7:1, 11:1, 13.5:1). Zur Bestimmung der Allelfrequenzen wurde DNA von &lt;100 unverwandten Personen aus dem K&ouml;lner Raum mit Perkin Elmer GeneAmp 2400-Maschinen amplifiziert. Der PCR- Ansatz (Endvolumen 25 µL) enthielt 10 ng DNA, 37,5 mM MgCl2, 3,75 µM dNTP mix, 50 µM primer each und 1 U Taq-Polymerase (Promega, Madison) in 1x Promega PCR-Puffer. Mineral&ouml;l zur Abdeckung wurde nicht benutzt. Die Primersequenzen und die Nomenclature der DNA-Loci entsprechen den Originalver&ouml;ffentlichungen, der Buchstabe  X symbolisiert f&uuml;r Floureszenzmarkierung. Die Primersequenzen:<br>


D8S306: <br>
5´- AGA GAA AGA GAG ACA GAA AGA GAG A - 3´<br>
5´- X GTT GAA CAG GAG CAG TGA GAG AG - 3´<br><br>
PKLR:<br>
5´- X GGC TGG TTC TCG TTA CAG - 3´<br>
5´- CTG AGG TCA GGA GTT TGA G - 3´<br>
Die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte (FITC, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) wurden in vertikalen, 0,5 mm dicken 5% Polyacrylamidgelen (Hydrolink Long Ranger, Serva, Heidelberg, Deutschland) mit der Laserdetektionseinheit des A.L.F.-Sequencers (gr&uuml;ner Laser; Pharmacia Biotech) [10] vorgenommen; die Trennstrecke von der Ladetasche bis zu den Detektoren betrug 19 cm. Laufbedingungen: 1500 V, 38 mA, 34 W, Wassertemperatur in den Thermostatisierplatten: 40 °C, Laserleistung: 2 mW.<br>
Die Darstellung und Auswertung der Fragmente wurde mit der A.L.F. Fragment Manager-Software durchgef&uuml;hrt. Als Referenzleiter dienten Referenzfragmente (100 bp + 300 bp-Mix (je 2 µL) und der 50-500 bp ladder (0,8 µL) - beide von Pharmacia Biotech).<br>
PCR-Bedingungen: 29 Zyklen; PCR program: 30 sec 94°C (Anfangsdenaturierung); 20 sec 94°C, 20 sec 60,5 °C (D8S306) bzw. 58°C (PKLR), 50 sec 72°C; 30 sec 72°C (Schlu&szlig;extension).<br>


Statistik: Das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht wurde mittels des exact test ermittelt [3]1[ask1], der im Softwarepaket "DNA View" (Charles Brenner, Berkeley, Ca.) integriert ist. Der Chi2-Test wurde nicht benutzt, weil er eine Gaussverteilung der Allele voraussetzt, die nicht in allen STR-Systemen gegeben ist. In der Ver&ouml;ffentlichung von Guo & Thompson finden sich zwei Ungenauigkeiten. In Formel 1 mu&szlig; k als m gelesen werden; im Nenner derselben Formel mu&szlig; das &lt;-Zeichen durch  oder  ersetzt werden.<br>


Die discriminating power wurde als 1- (erwartete Ph&auml;notypenfrequenz)2 gem&auml;&szlig; Fisher 1951 ermittelt (nach [5]). Die expected exclusion chance f&uuml;r Vaterschaftsf&auml;lle wurde wiederum mit dem DNA View- Softwarepaket errechnet. <br>


<font color=orange>Ergebnisse und Diskussion</font> <br>

F&uuml;r PKLR konnten in der von uns untersuchten Population 18 von 21 rechnerisch m&ouml;glichen Genotypkombinationen nachgewiesen werden, bei D8S306 traten 29 von 45 m&ouml;glichen Genotypen auf. Beide STR-Systeme lieferten auch mit h&ouml;heren Mengen von Ausgangs-DNA (bis zu 20 ng) noch Ergebnisse. Gegen&uuml;ber der Erstbeschreibungen der primer fanden wir in der von uns untersuchten Population f&uuml;r PKLR aund D8S306 nur geringe Abweichungen zu den dort genannten Allelh&auml;ufigkeiten (Tabelle 1). <br>

D8S306:               K&ouml;lner Raum, n=159          Nelson et al. 1994, n=192<br>
<br>
Allel  1 (290 bp)          5                                              2
<br>Allel 2                         9                                             12
<br>Allel 3                       16                                             17
<br>Allel 4                       20                                             15
<br>Allel 5                       22                                             26
<br>Alle 6                        17                                             15
<br>Allel 7                         6                                               7
<br>Allel 8                         4                                               4
<br>Allel 9                         0,6                                            3
<br>Allel 10 (244 bp)        0,3                                            1
<br>
PKLR:<br> 
<br>Allel                    K&ouml;lner Raum, n=165          Lenzner et al. 1994, n =82<br>
<br>
1 (331 bp)                    6                                               7
<br>2                                17                                              10      
<br>3                                32                                              13
<br>4                                39                                              46
<br>5                                10                                                4
<br>6 (316 bp)                  11                                              20
<br>

Tab. 2: Allelh&auml;ufigkeiten f&uuml;r D8S306 und PKLR (in Prozent)<br>
<br>
Die Fluoreszenzmarkierung von D8S306 sollte an der angegebenen Stelle erfolgen, da die Markierung des anderen Stranges zu einer deutlichen slippage-Bande in den PCR-Produkten f&uuml;hrt. Tabelle 2 gibt eine &Uuml;bersicht &uuml;ber die weiteren Eigenschaften der beiden von uns untersuchten STRs.<br>
<br>
Lokus<br>
D8S306<br>
PKLR<br>

Kernsequenz<br>
(AAAG)n<br>
(ATT)n<br>
<br>
Repeatstruktur<br>
Tetranukleotid-repeat<br>
Trinukleotid-repeat<br>
<br>
L&auml;nge (in bp)*<br>
244-290<br>
316-331<br>
<br>
Allele<br>
10<br>
6<br>
<br>
Heterozygosit&auml;t<br>
(Angabe in Originalver&ouml;ffentlichung)<br>
79%
(78%)<br>
76%
(72%)<br>
<br>
discriminating power f&uuml;r beliebige Personen (Spurenanalyse)<br>
0.96<br>
0.94<br>
<br>
exclusion chance in Vaterschaftsf&auml;llen<br>
0.68<br>
0.54<br>
<br>
Untere Detektionsgrenze (Sensitivit&auml;t) f&uuml;r Heterozygoten<br>
30 pg<br>
250 pg<br>
<br>
Unterschiedbare DNA-Mischungen (Verh&auml;ltnisangaben)<br>
2:1, 3.5:1, 2:1, 3.5:1, 7:1<br>

Hardy-Weinberg- Gleichgewicht (p-Wert)<br>
+<br>
(0.29054)<br>
<br>
+ <br>
(0.00035)<br>
<br>
Tabelle 2: Eigenschaften der STR-Systeme PKLR und D8S306<br>
*: aus den Originalver&ouml;ffentlichungen &uuml;bernommen<br>
<br>
Die beiden STR-Systeme D8S306 und PKLR k&ouml;nnen in der forensischen DNA-Diagnostik sowie bei Vaterschaftsuntersuchungen eine hilfreiche Erg&auml;nzung zu den Untersuchungen mit den Standard-STRs bieten. Besonders D8S306 ist wegen seiner hohen Sensitivit&auml;t sowohl in Spurenf&auml;llen als auch bei der Konstruktion von Multiplexsystemen [3] gut einsetzbar.<br>
 

<font color=orange>Literatur</font><br>

* 1.Benecke M, Prinz M, Schmitt C: Forensic efficiency and german population data for the <A HREF="santiago.html">tetrameric STR polymorphism DHFRP2 (HUMFOLP23)</A>. Advances in Forensic Haemogenetics 6, 229-231
* 2. Benecke, M, Schmitt C, Staak M., <A HREF="develop.html"> Development of a fast new STR triplex system for identification of urine</A> samples. Proceedings of the First European Symposium on Human Identification, Toulouse, 29.-31.5.1996 (Promega Corp.), in Druck
* 3.Guo SW, Thompson EA (1992) Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 48: 361-372
* 4.Kimpton CP, Gill P, Walton A, Urquhart A, Millican ES, Adams M (1993) Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Meth Appl 3: 13-22
* 5.Klintschar M (1995) Validation of the STR system FES/FPS for forensic purposes in an austrian population sample. Int J Leg Med 108: 162-164
* 6.Lenzner C, Jacobasch G, Reis A, Thiele B, N&uuml;rnberg P (1994) Trinucleotide repeat polymorphism at the PKLR locus. Hum Mol Gen 3: 523
* 7.Lygo JE, Johnson PE, Holdaway DJ, Woodroffe S, Whitaker JP, Clayton TM, Kimpton CP, Gill P(1992) The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework. In J Leg Med 107: 77-89
* 8.Nelson L, Riley R, Lu J, Robertson M, Ward K (1993) Tetranucleotide repeat polymorphism at the D8S306 locus. Hum Mol Gen 2: 1984
* 9.Schmitt C, Schmutzler A, Prinz M, Staak M (1994) High sensitive DNA typing approaches for the analysis of forensic evidence: camparison of nested variable number of tandem repeats (VNTR) amplification and a short tandem repeats (STR) polymorphism. For Sci Int 66: 129-141
* 10.Schmitt C, Prinz M (1996) Anwendbarkeit eines DNA-Sequenzierautomaten f&uuml;r die PCR-Typisierung von forensischen Spuren. Rechtsmedizin 6: 45-48
* 11.Wiegand P, Budowle B, Rand S, Brinkmann B (1993) Forensic validation of the STR systems SE33 and TC11. Int J Leg Med 105: 315-320
<br>


<font color=orange>Danksagung</font><br>

MB wird vom Bundesinstitut f&uuml;r Sportwissenschaften (BISP), K&ouml;ln, unterst&uuml;tzt (Projektnummer VF 0407/08/03/95). MB dankt Dr. Plewe (Math. Inst. d. Univ. zu K&ouml;ln),  Dr. Brenner (Berkeley, Ca.) und Dr. Klintschar (Inst. f. gerichtl. Med. der Univ. Graz) f&uuml;r die Diskussion mathematischer Fragen. Dr. Edelmann (Inst. f. gerichtl. Med. d. Univ. Leipzig) hat freundlicherweise die exact test-Werte und die expected exclusion chance in Vaterschaftf&auml;llen berechnet. <br>


<font color=orange>Annnotation</font><br>

In Guo & Thompsons original paper two minor errors were detected. In fomula (1) k is m; in the nominator of the same formula, &lt; has to be substituted by "greater than/equal" or "lesser than/equal".   
<br><br>


===<font color=orange>Lesetipps</font>===
<i>
* [[All Rechtsmedizin|Alle Artikel von MB in der Rechtsmedizin]]<br>

* [[2014-05-22/23 Interdisziplinaeres Forum Forensik IFF Arbeitstagung|Tagung „(Sexuelle) Gewalt und Tötungskriminalität im forensischen Kontext“ des Interdisziplinären Forums Forensik]]<br>

* [[01 2014 DGRM: V. Curso Inernational de Entomologia Forense|V. Curso Internacional de Entomologia Forense]]<br>

* [[2013-09-05/06 Interdisziplinaeres Fachforum: SOKO Rechen|Interdisziplinäres Fachforum Rechtsmedizin: Soko “Rechen”: Ein Fall von Kannibalismus]]<br>

* [[2012-09-13/14 Interdisziplinäres Fachforum: Der Fall Mirko|Interdisziplinäres Fachforum: Der Fall Mirco]]<br>

* [[2011-09-22/23 Kongress Todesermittlungen: Siebenfachmord von Sittensen|Tagung „Todesermittlungen“ des Interdisziplinären Fachforums Rechtsmedizin]]<br>

* [[2011 Rechtsmedizin: H2O Criminalistics & Pathology Symposium, Magna Graecia Universität|H<sub>2</sub>O Criminalistics & Pathology Symposium, „Magna Graecia“ Universität]]<br>
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