2004-02-18 Malte Bücken: Der genetische Fingerabdruck

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Hildegard-von-Bingen Gymnasium

Schuljahr 2003/2004

 

Facharbeit im Fach Chemie

 

Betreuer: Herr Klomp

 

Der genetische Fingerabdruck und die Isolation von DNA am Beispiel der Ionenaustausch-Chromatographie

 

 

vorgelegt von

 

Malte Bücken

 

Köln, den 18. Februar 2004

 

 

Malte Bücken

Lohrbergstrasse 3

50939 Köln

Tel: 0221 / 46 23 21

 

 

Vorwort:

 

An dieser Stelle möchte ich Herrn Dr. Benecke danken, für die Hilfe, die er mir bei der Thema- und natürlich auch der Materialsuche gegeben hat. Ohne ihn hätte ich wohl nicht das umfangreiche Material zusammenstellen können, dass ich für diese Facharbeit zur Verfügung hatte. Ebenfalls danken möchte ich den freundlichen Service-Mitarbeitern der Firma Qiagen, die mir bereitwillig das Informationsmaterial ihrer Firma zugeschickt haben.


1. Einleitung

 

In der heutigen Gesellschaft werden Analysemethoden personenspezifischer Merkmale zwecks eindeutiger Identifizierung immer wichtiger. Im Laufe weniger Jahre ist ein ganzer Wirtschaftszweig entstanden, der sich allein dem Thema widmet, Menschen anhand ihres Erbgutes einwandfrei identifizieren zu können. Die Polizei und auch Privatpersonen, z.B. beim Vaterschaftstest, profitieren von dieser Technik maßgeblich. Doch nur wenige Menschen wissen, wie eine DNA-Analyse theoretisch funktioniert, und wie viele Arbeitsschritte dafür überhaupt nötig sind. Diese Facharbeit widmet sich einem dieser Teilschritte, nämlich der Isolation von vollwertiger DNA. Nachdem zuerst die Begriffe DNA und der genetische Fingerabdruck erläutert werden, sollen verschiedene Isolationsverfahren kurz angeschnitten werden. Als Beispiel einer solchen Vorgehensweise soll auf die Verwendung der Ionenaustausch-Chromatographie näher eingegangen werden.

 

2. Desoxyribonukleinsäure (DNA) als Träger der genetischen Information

 

2.1. Historie der DNA

 

Der Begriff DNA kommt aus dem Englischen und steht für „deoxyribonucleic acid“. In Deutschland ist DNA auch unter dem Synonym DNS bekannt („Desoxyribo-Nuklein-Säure“). Es ist das Erbsubstanzmolekül aus dem Zellkern (dann ist es Kern-DNA oder nukläre DNA) oder aus den Mitochondrien (mtDNA). Im Zellkern ist die DNA Träger der genetischen Information und der Hauptbestandteil der Chromosomen.

Die DNA wurde von Friedrich Miescher im Jahre 1871 entdeckt. Miescher isolierte sie zunächst aus weißen Blutzellen, ihre Funktion blieb aber unklar. Zu diesem Zeitpunkt dachte man noch, dass Proteine die Erbsubstanz bilden. Erst 1944 konnte Avery nachweisen, dass die DNA das transformierende Prinzip[1] ist. Später konnte mit Hilfe radioaktiver Markierungen nachgewiesen werden, dass Sie die universelle Erbsubstanz ist.

 

2.2. Bausteine und Aufbau der DNA

 

Ein DNA-Molekül setzt sich aus sechs unterschiedlichen Komponenten zusammen:

Zum einen aus vier Stickstoffbasen, zum anderen aus Phosphorsäure und Desoxyribose. Bei den Stickstoffbasen gibt es einerseits die Pyrimidine Cytosin (C4H4N3O) und Thymin (C5H5N2O2) - sie bestehen aus einem Ring - und andererseits die Purine Adenin (C5H4N5) und Guanin (C5H4N5O), die jeweils zwei kondensierende Ringe bilden. Die Desoxyribose (C5OH7) ist eine Pentose, ein Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen. Anders als die Ribose hat die Desoxyribose kein Sauerstoffatom am zweiten Kohlenstoffatom (vgl. Schaubild). Phosphorsäure (H3PO4) hat die Eigenschaft zwei Zuckermoleküle durch Ester-Bindungen[2] miteinander verbinden zu können.

Die DNA bezeichnet man auch als ein Polynukleotid, denn jeweils eine Desoxyribose, eine Base und eine Phosphorsäure bilden ein Nukleotid. Je nachdem welche Base verwendet wird, heißt das Nukleotid anders. So würde es z. B. bei der Base Adenin Desoxy-Adenosin-Monophosphat (dAMP) heißen. Die anderen Nukleotide heißen dem entsprechend dCMP, dGMP und dTMP.

Die Kette, die sich aus den einzelnen Nukleotiden bildet, hat einen Richtungssinn. Sie beginnt, wie sie aufhört: mit einer freien Hydroxyl(OH-)-Gruppe[3]. Mit Hilfe von Röntgenstrukturanalysen ist man heutzutage in der Lage, zu erkennen, dass das DNA-Molekül die räumliche Form einer doppelten Schraube hat („Doppelhelix“).

 

3. Der genetische Fingerabdruck

 

3.1. Geschichte des genetischen Fingerabdrucks

 

Das Jahr 1953 ist ein wichtiges Jahr für die Wissenschaft. Der Brite Francis Crick und der Amerikaner James Watson veröffentlichen die Doppelhelix des menschlichen Erbgutes, die Struktur der DNA. Doch es dauert weitere 30 Jahre, bis es zum ersten Einsatz einer DNA-Analyse kommt. Der britische Humangenetiker Sir Alex Jeffreys entwickelt ein Verfahren, mit dem man aus menschlichen Zellen ein typisches Gen-Muster „herauslesen“ kann, das nicht für bestimmte Merkmale verantwortlich und gleichzeitig doch für jeden Menschen einzigartig ist.

Einen genetischen Fingerabdruck vergleicht der deutsche Molekularbiologe Dr. Mark Benecke mit dem Binärcode auf einem Milchkarton: „Er bezeichnet das Objekt eindeutig, sagt aber gleichzeitig nichts über seinen Zustand aus. Folglich kann aus einem genetischen Fingerabdruck keinerlei weiterführende Information, z.B. zum Körperbau, über die betroffene Person gelesen werden.“ [4]

 

3.2. Zum Begriff „Genetischer Fingerabdruck“

 

Als Sir Alec Jeffreys die DNA-Analyse erfand, kreierte er gleichzeitig den Begriff, den heute jeder kennt: „Genetic Fingerprint“. Zu Deutsch „genetischer Fingerabdruck“. Er möchte damit die Verbindung zu der Ermittlungsmethode herstellen, die vor seiner Entdeckung als Identifizierungsmöglichkeit genutzt wurde: den „herkömmlichen“ Fingerabdruck. Denn wie die Vorgängerversion kann der genetische Fingerabdruck seinen „Besitzer“ eindeutig identifizieren – nur dass die Menge der Anwendungsmöglichkeiten ungleich größer ist.

 

3.3. Der Strichcode

 

Die Technik, die Sir Alec Jeffreys entwickelte, basiert auf einem „Strichcode“. Vereinfacht ausgedrückt wird die isolierte DNA zuerst durch Restriktionsenzyme zerkleinert. Die Restriktionsenzyme bewirken, dass die DNA an bestimmten bekannten Basen getrennt wird. Auf diese Weise werden nichtcodierende DNA-Abschnitte freigelegt. Diese gibt man nun auf ein Gel aus Polyacrylamid und setzt sie unter Strom. Damit lädt man das obere Ende des Gels negativ und das untere Ende positiv auf. Die negativ geladene DNA wird nun vom unteren, positiv geladenen Ende des Gels angezogen. Nach circa drei Stunden unterbricht man die elektrophoretische[5] Trennung. Mit diesem Verfahren erreicht man, dass die DNA-Fragmente ihrer Länge nach sortiert werden. Gel-Sonden markieren die DNA-Fragmente (vgl. Schaubild), und ein Muster, das für jeden Menschen einzigartig ist, entsteht: Der Strichcode.

 

4. Isolationsmethoden

 

Die folgenden Erläuterungen beruhen größtenteils auf den Ausführungen von Qiagen (Hg.): Qiagen Plasmid Purification Handbook. Hilden 2002. Es gibt viele verschiedene Methoden und Technologien, um genetische DNA zu isolieren. Die meisten Methoden beinhalten die Trennung und Lysis[6] des Startmaterials, z.B. einer Blut- oder Haarprobe, gefolgt vom Entzug der Proteine und anderer Fremdstoffe. Als Ergebnis erhält man die DNA.

Der Entzug von Proteinen wird oft durch das Digerieren mit Proteinase K[7] eingeleitet. Als nächstes beginnt man mit der Isolation von DNA, z.B. durch Aussalzen, durch organische Extraktion, oder man bindet die DNA an einen Feststoff: entweder durch Anionenaustausch-Chromatopgrahie oder das Silica-Verfahren[8].

Die DNA erhält man dann generell durch die Ausfällung mit Ethanol (C2H5OH) oder Isopropanol (CH3–CH(OH)–CH3). Welche Methode man verwendet, hängt letzten Endes von mehreren Faktoren ab: Von der benötigten Menge, der molekularen Masse, der Reinheit, die für die Anwendung erfordert wird, von der Zeit und natürlich den Kosten. Einige Möglichkeiten werden in diesem Abschnitt erklärt, auch wenn es selbst bei diesen Methoden unterschiedliche Arbeitsweisen gibt. Generell kann die Isolation von DNA, also auch die im Folgenden näher erläuterten Isolationsmethoden, in vier Phasen eingeteilt werden:

  1. Spaltung
  2. Lysis
  3. Entfernung von Proteinen und Fremdstoffen
  4. Gewinnung von DNA

Bei einigen Methoden werden die Phasen 1 und 2 kombiniert.

 

4.1. Aussalzung

 

Eine konventionelle Methode, um Proteine und andere Fremdstoffe zu entfernen, ist das „Aussalzen“. Dabei werden die Proteine aus dem unverarbeiteten Lysat[9] durch hohe Konzentrationen an Salz, z.B. Kaliumacetat (KC2H3O2) oder Ammoniumacetat (CH3COONH4), präzipitiert. Durch eine Zentrifuge werden die Fällungsprodukte entfernt, und die DNA kann mit Hilfe einer Ausfällung erlangt werden.

Diese Methode ist äußerst ineffizient und eine Wiederholung der Schritte oft notwendig, weil die Menge und Reinheit der erzielten DNA stark schwankt.

 

4.2. Organische Extraktion

 

Die organische Extraktion ist effektiver als die Aussalzung. Sie verwendet organische Lösemittel, um Fremdstoffe aus Zell-Lysat zu extrahieren. Mit Hilfe von Lysine werden die Zellen aufgelöst und dann mit Phenol[10] (C6H6O), Chloroform (CHCl3), und Isoamylalkohol [(CH3)2CHCH2CH2OH] vermischt. Während der gesamten Prozedur muss gesichert sein, dass die korrekte Salzkonzentration und der richtige PH-Wert vorliegen, damit gewährleistet ist, dass alle Fremdstoffe in organische Phasen unterteilt werden und dass die DNA in wässriger Lösung bleibt. Auch hier wird die DNA durch Präzipitation mit Alkohol gewonnen.

Das organische Extraktionsverfahren ist sehr zeitintensiv und schwierig. Die isolierte DNA kann Phenol und/oder Chloroform enthalten, was zur Folge haben kann, dass Enzymreaktionen beim Gebrauch der DNA geblockt werden. Außerdem entstehen bei dieser Methode giftige Abfallstoffe, die entsorgt werden müssen.

 

4.3. Cäsiumchlorid-Dichte-Verfahren

 

Dieses Verfahren nutzt den Verlauf der Cäsiumchloriddichte. Zellen werden durch Lysine aufgelöst und das Lysat mit Alkohol ausgefällt. Die resuspendierte DNA wird für mehrere Stunden zusammen mit Cäsiumchlorid (CsCl) in Gegenwart von Ethidiumbromid[11] (C21H20N3Br) ultrazentrifugiert. Die DNA-Verbindung wird aus der Zentrifuge entfernt und dann wird die DNA mit Isopropanol extrahiert um das Ethidiumbromid zu lösen. Durch Ausfällen mit Ethanol erhält man die gereinigte DNA.

Durch dieses Verfahren erhält man hochwertige DNA, allerdings ist es wie das organische Extraktionsverfahren sehr zeitintensiv und außerdem an hohe Kosten gebunden (durch die Zentrifuge). Als Nebenprodukt der Verwendung von Ethidiumbromid entstehen Giftstoffe, die entsorgt werden müssen. Ein weiterer Schwachpunkt dieser Methode ist, dass sie nicht automatisiert werden kann.

 

4.4. Silica Adsorption

 

Als eine einfache und schnelle Variante bietet sich das Silica Adsorptionsverfahren an. Die Nukleinsäure wird von einer Silicagel-Membran adsorbiert. Chaotropische[12] Salze, wie z.B. Natriumiodid (NaI), unterstützen diesen Vorgang. Verschiedene Puffer im Lyse[13]-Prozess sorgen dafür, dass nur die DNA adsorbiert wird, während Fremdstoffe, wie Zellproteine und Metaboliten, in Lösung bleiben und ausgewaschen werden.

Neben der Anionenaustausch-Chromatographie ist das Silica Adsorptionsverfahren das effektivste. Sie ist einfach zu handhaben, kann automatisiert werden, und es wird keine Ethanolpräzipitation benötigt, da die DNA mit einem Puffer direkt aus der Membran eluiert wird.

 

4.5 Ionenaustausch-Chromatographie

 

Neben den bisher beschriebenen Methoden gibt es ein weiteres, vom chemischen Standpunkt aus gesehen sehr interessantes, Verfahren, die Ionenaustausch-Chromatographie. Da es sich dabei um die aktuell am meisten angewandte Technologie handelt, soll auf sie im Folgenden detailliert eingegangen werden.

 

5. Die Ionenaustausch-Chromatographie

 

Wenn man die verschiedenen Isolationsverfahren miteinander vergleicht, lassen sich starke Qualitätsunterschiede feststellen. So würde man z.B. das Cäsiumchlorid-Dichte-Verfahren zweimal durchführen müssen, um die gleiche Qualität der DNA zu erreichen, die man mit Hilfe der Silica Adsorption oder auch der Ionenaustausch-Chromatographie erreichen kann. Desweiteren entstehen bei den beiden letzteren Verfahren keinerlei giftige Abfallstoffe, wie Phenol oder Ethidiumbromid. Deswegen sind die meisten Unternehmen schon früh dazu übergegangen, diese beiden zu verwenden, und es gibt viele so genannte „Kits“ zu kaufen, die diese Methoden automatisch durchführen können.

 

5.1. Allgemeines zur Ionenaustausch-Chromatographie

 

Die Ionenaustausch-Chromatographie ist eine Art der Säulenchromatographie. Anwendung findet die Ionenaustausch-Chromatographie vor allem in der Biochemie. Man verwendet sie zur Trennung von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Fragmenten mikrobieller Zellwände, Antibiotika und Vitamine. Die Ionenaustauscher sind in der Regel polymere Harze oder Gele mit einer Korngröße von 0.08 bis 0.15 mm. In die Ionenaustauscher, mit denen die Trennsäulen gefüllt sind, werden ionische Gruppen eingebaut, welche Gegenionen reversibel binden können.

Der Ionenaustausch findet an Festionen statt, z.B.SO3- oder NH3+. Diese sind auf einem Träger (auch Matrix genannt), z.B. einem polymeren Harz, fest verankert. Die Festionen, in diesem Fall SO3-, binden reversibel ein Gegenion, z.B. Na+ (Siehe Bild). Diese Gegenionen können durch andere Ionen ersetzt werden. Je nachdem ob ein Kation oder ein Anion gebunden wird, liegt ein Kationen- bzw. Anionenaustauscher vor.

 

5.2. Selektivitätsreihe

 

Um Ionen überhaupt mit der Ionenaustausch-Chromatographie trennen zu können, muss eine gewisse Selektivität vorhanden sein bezüglich der Bindung an das Festion. Vorteilhaft dafür sind Ionen mit höherer Ladung, mit einem kleineren Durchmesser und mit besserer Polarisierbarkeit. Damit man weiß, welches Gegenion durch das sich im Eluenten befindende Ion verdrängt werden kann, gibt es Selektivitätsreihen. Für die Isolation von DNA ist nur die Anionenreihe von Bedeutung, hier wird sie, vereinfacht, einmal dargestellt:

 

Acetat < F- < OH- < Formiat < Cl- < SCN- < Br- < CrO42- < NO3- < I- < Oxalat < Sulfat < Citrat

 

Steht das im Eluent befindliche Ion in der Selektivitätsreihe rechts des Gegenions, so geht das Gegenion in Lösung und das Festion bindet das Ion (siehe Grafik). Die Selektivität zum Festion bewirkt eine Verdrängung auch innerhalb der Probe selbst. Dadurch kommt es während der Elution zur Trennung des Ionengemisches. Da es sich um eine reversible Reaktion handelt, kann es vorkommen, dass das Gegenion auch wieder an das Festion gebunden wird und zwar, wenn es in hoher Konzentration vorliegt. Diese Tatsache ist wichtig für die Isolation von DNA.

 

5.3. Die Trennung

 

Sobald sich ein Gegenion vom Festion gelöst hat, befindet es sich in der mobilen Phase. Es wandert nun in der Säule und versucht wie die sich noch im Elutionsmittel befindlichen Ionen, sich an ein Festion zu binden. Da sich die Ionen nur dann bewegen, wenn sie sich in der mobilen Phase befinden, trennen sich die Ionen voneinander. Denn die Ionen, die es schaffen sich länger an ein Festion zu binden, wandern langsamer als solche, die sofort wieder gelöst werden. Folglich kommt es zu einer Auftrennung im Stoffgemisch. Die einzelnen Proben, die das Ergebnis der Chromatographie darstellen, können jetzt mit verschiedenen Verfahren, wie der Gleichstromamperometrie[14], so untersucht werden, dass die Proben mit den höchsten Konzentrationen des gesuchten Ions gekennzeichnet werden.

 

5.4. Die Ionenaustausch-Chromatographie bei der Isolation von DNA

 

Bei der Isolation von DNA kann man sich die Eigenschaft der Erbsubstanz zu Nutze machen, dass sie zum Teil aus Phosphaten bestehen. Diese sind negativ geladen und dadurch ideal geeignet für eine Chromatographie mit Anionenaustauschern. Als Festion für die DNA dient Diethylaminoethylalkohol [(C2H5)2NC2H4OH] (DEAE), welcher positiv geladene Gruppen enthält (siehe Bild). Der Vorteil dabei ist, dass es eine relativ hohe Spannungs-Dichte vorhanden ist. Kieselgel (Silica) mit hoher Porengröße (100µm) und einer hydrophilen Hülle unterstützt dies als Ionenaustauscher noch. Die große Oberfläche des Kieselgels erlaubt eine dichte Verkupplung der DEAE Gruppen.

 

5.4.1. Die Extraktion von Fremdstoffen und DNA

 

Um die DNA von Fremdstoffen wie RNA, Eiweißen, Kohlenhydraten und kleinen Metaboliten zu trennen, wird Natriumchlorid (NaCl) zusammen mit einem Puffer verwendet. Da die Salzkonzentration und der pH-Wert der Puffer[15] beeinflussen, ob die DNA oder die Fremdstoffe gelöst werden, setzt man erst einen pH-Wert von 7.0 und eine Konzentration von 1.3 M NaCl ein. Dadurch werden alle Fremdstoffe ausgewaschen, nur die DNA bleibt noch an die Festionen gebunden (siehe Grafik). Sind alle Fremdstoffe entfernt, setzt man die Natriumchlorid Konzentration hoch auf 1.8 M, dadurch wird sichergestellt, dass die gesamte DNA ausgewaschen wird, denn, wie weiter oben[16] erwähnt wird, ein kann Ion mit einer hohen Konzentration auch ein Ion, das links des anderen in der Selektivitätsreihe steht, verdrängen.

 

5.4.2. Puffer

 

Der pH-Wert, und damit die Löslichkeit der DNA, hängt stark von der Wahl des Puffers ab. Je höher der pH-Wert desto näher liegen die Werte für die Löslichkeit der DNA und der Fremdstoffe aneinander. Deswegen ist es wichtig, den richtigen Puffer auszusuchen. Denn bei einem pH-Wert von 6.0 liegt die Konzentration von NaCl für die Auswaschung der DNA bei 1600mM (Fremdstoffe 1200mM), während bei einem pH-Wert von 8.0 nur noch 800mM NaCl (Fremdstoffe 600mM) benötigt werden, um die DNA von den Festionen zu lösen (siehe Graph). Folglich kann es bei einem zu hohen pH-Wert schnell dazu kommen, dass nicht nur Fremdstoffe, sondern auch DNA ausgewaschen wird.

Geeignete Puffer sind, z.B., Natriumphosphat [Na2H(PO4)], Natriumacetat (CH3COONa) oder Morpholinopropansulfonsäure (MOPS). In den meisten Fällen wird MOPS verwendet, da es einen pKs-Wert von 7.2 besitzt und folglich ein besonders guter Puffer bei pH 7 ist.

 

6. Schlussbemerkung

 

Die DNA und damit der genetische Fingerabdruck ist ein so komplexes Thema, dass es die Wissenschaft auch in Zukunft noch weiter beschäftigen wird. Auch 20 Jahre nach dem ersten erfolgreichen Feldversuch einer DNA Analyse hat das Thema nichts von seiner Faszination verloren. Das Beispiel der Ionenaustausch-Chromatographie sollte zeigen, dass es sich bei dieser Methode um ein leistungsstarkes Verfahren handelt, das eine korrekte und automatisierbare DNA-Analyse erst ermöglicht. Damit kann sie mit Recht als die effektivste Methode zur Isolation von DNA bezeichnet werden.

Auf Grund der Komplexität des Themas konnte in diesem Text nicht auf weitere Teilschritte der DNA-Analyse eingegangen werden. Trotzdem sollte jetzt deutlich sein, dass es sich bei allen Teilschritten um höchst genaue und sichere Vorgänge handelt, die eine korrekte Bearbeitung garantieren.

 

7. Literaturverzeichnis

 

Literaturquellen:

 

-         Bayrhuber, Horst (Hg.) u.a: Linder Biologie. Hannover 199821

-         Benecke, Mark: Kriminalbiologie. Bergisch Gladbach 1999.

-         Benecke, Mark: Mordmethoden. Ermittlungen des bekanntesten Kriminalbiologen der Welt. Bergisch Gladbach 2002.

-         Christner, Jürgen: Genetik. Stuttgart 2000.

-         Gritter, R.J. u.a.: Einführung in die Chromatographie. Aus dem Englischen von Andreas Groß und Martin Czok. Berlin 1987.

-         Qiagen (Hg.): Qiagen Plasmid Purification Handbook. Hilden 2002.

-         Sokol, Bettina (Hg.): Der gläserne Mensch. DNA-Analysen, eine Herausforderung an den Datenschutz. Düsseldorf 2003.

 

Internetquellen (auf CD):

 

-         http://www.biologe.de/Skripte/methodenprotokolle/html/Isolierung%20genomischer%20DNA.htm (10.02.2004)

-         http://www.dumgal.gov.uk/Services/depts/educate/genetics/dnaisolation.htm (10.02.2004)

-         http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_partIII.html (10.02.2004)

-         http://www.google.de/search?q=cache:7zKEDnt1U-kJ:article.pubs.nrc-cnrc.gc.ca/ppv/RPViewDoc%3F_handler_%3DHandleInitialGet%26journal%3Dcjfas%26volume%3D55%26calyLang%3Deng%26articleFile%3Df97-296.pdf+organic+extraction+dna+explanation+phenol&hl=de&ie=UTF-8 (10.02.2004)

-         http://www.medical-genetics.de/fachbereiche/molekulargenetik.html (10.02.2004)

-         http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/nbt/journal/v21/n2/full/nbt0203-209.html (10.02.2004)

-         http://www.wdr.de/tv/aks/seiten/dr_fiedler/themen/g/gentests_bekr.html (10.02.2004)

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-         http://www.hitech.at/archiv/3_97/forensik.htm (10.02.2004)

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-         http://www.mpi-sb.mpg.de/~len/htmlskript/node11.html (10.02.2004)

-         http://www.polizei.sachsen-anhalt.de/inet-sdl/dnainfo.htm (10.02.2004)

 

PDF-Dateien (auf CD):

 

-         http://sundoc.bibliothek.uni-halle.de/diss-online/03/03H127/prom.pdf (10.02.2004)

-         http://www.av.fh-koeln.de/professoren/rehorek/files/PA_Ionenaustauschchromatographie_Senhold_0201.pdf (10.02.2004)

-         http://www.imtek.uni-freiburg.de/cpi/DNA-Sommer02-Teil1.pdf (10.02.2004)

-         http://www.ou.edu/journals/dis/DIS84/Tec8%20Colton/Colton.pdf (10.02.2004)

-         http://www.roche-applied-science.com/prod_inf/biochemi/No.1_96/p9-11.pdf (10.02.2004)

-         http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/napi_man/pdf/chapter2/page_12-14.pdf (10.02.2004)



[1] Der Transformationsversuch von Fred Griffith bildete die Grundlage für den Nachweis, dass DNA die Erbsubstanz ist: Griffith infizierte Mäuse mit Bakterien verschiedener Stämme.

[2] Esterbindung: Erfolgt zwischen einer Säure und einer weiteren Säure oder einem Zucker unter Abspaltung von H2O

[3] Die OHGruppe liegt am 5’-Atom der Desoxyribose. Neue Nukleotide werden immer am 3’-Kohlenstoff des Zuckers unter Wasserabspaltung angefügt

[4] Benecke, Mark: Kriminalbiologie. Bergisch Gladbach 1999. S. 54

[5] Elektrophorese - Die Wanderung elektrisch geladener Teilchen in flüssigen Medien im – möglichst homogenen – elektrischen Feld.

[6] Auflösung von Zellen (Bakterien, Blutkörperchen) nach Zerstörung der Zellmembran durch Lysine;

[7] Proteinase K, eine relativ unspezifische, aus dem Überstand des Pilzes Tritirachium isolierbare Serin-Protease (ähnlich dem Chymotrypsin)

[8] Siehe die jeweiligen Unterpunkten in Kapitel 4 und 5.

[9] Lyseprodukt von Zellen oder Mikroorganismen.

[10] Phenol: stark ätzendes, strukturell einem Alkohol ähnelndes Hydroxylderivat des Benzols (C6H5OH)

[11] Ein DNA bindendes Molekül mit dem man DNA Stränge unter UV-Licht erkennen kann. Hochgiftig.

[12] Auch bekannt unter dem Begriff „Hofmeister Reihe“.

[13] Siehe Begriff „Lysis“

[14] Diese Detektionsmethode lässt sich mit sehr guter Empfindlichkeit für die Detektion leicht oxidierbarer oder reduzierbarer Substanzen einsetzen. Die Detektorzelle, in welcher eine

elektrochemische Reaktion abläuft, besitzt 3 Elektroden. Zwischen Arbeits- und Referenzelektrode liegt ein wählbares Potential. Der über die Reaktion entstandener Strom wird über eine Hilfselektrode abgeleitet und gemessen. Die Arbeitselektrode besteht entweder aus Glaskohlenstoff, Kohlepaste oder amalgiertem Gold.

 

[15] Vgl. Henderson-Hasselbalch Gleichung (pH = pKs ± 1)

[16] siehe 5.1. Selektivitätsreihe


(c) Malte Bücken.


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